如何提取细胞膜（动物细胞）上的蛋白质 如何提取动物细胞膜
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：
（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。
（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。
（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体（Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
NRC Institute for Biological Sciences
Triton X-114 extraction protocol (Hydrophobic protein preparation)
Ressuspend cells in Solution A (dil 1/8) and add 15 μl of mammalian cocktail proteases inhibitor (Sigma).
Add 1 third of the volume of solution B
Incubate on ice for 1 hour with frequent vortexing.
Centrifuge at 10 000g for 10 minutes at 4°C to pellet unbroken cells and nuclei.
Transfer supernatant in clean eppendorfs then incubate at 30°C for 3 minutes (until sln is cloudy).
Centrifuge at 1 300g for 10 minutes at room temperature.
Transfer Aqueous phase in new eppendorf (but keep detergent phase at room temperature).
Add X volume of triton X-114 to Aqueous phase:
Vol of Aq phase = X vol of triton X-114
24.6
Shake well then incubate 3 minutes at 30°C (until cloudy) then transfer on top of detergent phase slowly.
Centrifuge at 1 300g for 10 minutes at room temperature.
Remove Aqueous phase with pipette down to detergent interphase.
Precipitate hydrophobic protein (detergent phase) with 10X volume of acetone. Place overnight at -20°C.
Pellet proteins by centrifugation at max speed for 10 minutes at 4°C. Ressuspend proteins in IEF sln (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT) then precipitate protein again with 10 volume of acetone. Place 5-10 min at -20°C.
Pellet proteins by centrifugation at max speed for 10 minutes at 4°C. Air dry pellet then dissolve protein in IEF solution
Solution:
Solution A: 80 mM Tris-HCl, pH 7.4 ; 1,2M NaCl
0,63 g Tris-HCl
3,51 g NaCl
Dissolve in 30 ml of water
Adjust pH to 7.4
Adjust volume to 50 ml with water
Solution B: 40 mM Tris-HCl, pH 7.4 ; 600 mM NaCl ; 4% triton X-114
5 ml of sln A
Add triton to have a final concentration off 4%
4% x 10 ml = ml
[triton X114]
Adjust volume to 10 ml with water
如何提取动物细胞膜~
倒入水中
让c吸水胀破
然后离心
取上层清液过滤
就能得到c膜
哺乳动物成熟的红细胞内只有血红蛋白
无核无c器
c膜主要成分是磷脂
质量分数比蛋白质小
离心后会分层
c膜处于上层清液中
鸡鸭血中的细胞器也会胀破
离心后同样能分离
糖脂
细胞膜是磷脂双分子层，其骨架是磷脂（脂质的一种），上有各种结合形态的蛋白质，构成非常非常著名的流动镶嵌模型。
另外细胞膜上也有少量糖蛋白，起细胞识别作用。
细胞膜上也有固醇类（脂质的一种），动物细胞膜上更多，与细胞柔韧、流动有关。
相关要点总结：
19515143179：提取细胞膜成份的方法
翟甄答：材料选取哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟红细胞没有细胞器，故不会有杂质。置入蒸馏水中，吸水涨破，离心。
19515143179：哺乳动物细胞实验方法
翟甄答：哺乳动物的成熟红细胞没有细胞器膜,放在蒸馏水中吸水涨破,可制备细胞膜。匿分离细胞器不同细胞器的大小、质量不同,故可用差速离心法分离细胞器。观察叶绿体叶绿体是体积较小的细胞器,在电子显微镜下才能观察清楚。️示踪技术利用放射性同位素示踪技术,研究分泌蛋白的合成与分泌,可清楚地观察到泌蛋白的合成与...
19515143179：细胞膜上的蛋白质在哪里合成
翟甄答：细胞膜上的蛋白质在线粒体中合成。线粒体（mitochondrion）是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。其直径在0.5到1.0微米左右。细胞膜主要是由磷脂构成的富有弹性的半透性膜，膜厚7～8nm，对于动物细胞来说，其膜外侧与外界环境...
19515143179：冻融法细胞膜提取实验方法
翟甄答：1、首先需要收集细胞样品，细胞样品可以来自于不同的生物来源，例如动物组织，植物组织或微生物培养物，收集到的细胞样品应当保持新鲜，并在低温条件下保存，以防止细胞膜的破坏。2、其次将细胞样品置于冷冻盒中，用液氮或冷冻机将其快速冷冻至低温，冷冻的过程会导致水分在细胞内部形成冰晶，从而对细胞膜...
19515143179：看到了你在知道发的问题,请问你知道怎么提取细胞培养液里的分泌蛋白吗...
翟甄答：我也不太清楚。你提取应该是液体培养的情况下吧，那抽取培养液做离心，再跑电泳，可不可以？
19515143179：高中生物去除植物细胞的细胞壁和 动物细胞培养 过程中 去除细胞间质...
翟甄答：但动物细胞没有细胞壁，它们是利用细胞间基质进行粘结的，各种蛋白质成分交联扭结在一起，物理方法很难使其分散，所以用胰蛋白酶水解基质中的蛋白质让它们分开。细胞间质嘛，放心吧，高中阶段是不需要掌握的，你就当做是我刚刚讲的细胞间的基质就好了，也可以理解为细胞原生质以外的所有成分。
19515143179：细胞膜蛋白的合成是如何运输的??是由核糖体合成然后直接运输到细胞膜...
翟甄答："由DNA在细胞核内进行转录成mRNA，运到细胞核外的核糖体进行蛋白质的初步合成。然后到内质网→高尔基体→细胞膜。这期间蛋白质的运输都是通过囊泡形式."补充一下前提条件是分泌蛋白才经过（高尔基体→细胞膜），如胰岛素，胃蛋白酶；但胞内酶却不经过，如有氧呼吸酶等等。
19515143179：如何鉴定.细胞膜上的蛋白, 细胞膜上有很多种蛋白,如何鉴别?
翟甄答：关键词 水通道蛋白,生理功能,调节 无论是动物还是植物,活细胞外面均有一层磷脂组成的双分子层,称为细胞膜,细胞膜对于进出细胞的物质有选择透过性,不同的膜蛋白具有运输不同化学物质的能力.水是活细胞的主要组成部分.在活细胞当中,水的比例占总重量的70%左右,大多数细胞的生化反应都是在水环境中进行...
19515143179：动物细胞膜的主要成分是什么?
翟甄答：动物细胞膜的主要成分是磷脂，胆固醇，蛋白质，糖类。动物细胞膜的成分和植物细胞膜的成分都是一样的，磷脂双分子层+膜蛋白+多糖。绝大多数的细胞的膜是由磷脂双分子层构成膜的骨架，以此为依托，在双分子层上镶嵌着蛋白质和多糖。这三种成分是所有的细胞的膜都有的物质。细胞膜 细胞膜主要是由磷脂...
19515143179：动物细胞膜识别信息的方法
翟甄答：膜张力调节：膜张力也可以影响细胞膜上的蛋白质和糖类分子，从而影响细胞间相互作用。例如，通过细胞间紧密连接的形成，可以保持细胞组织的完整性和功能。其他方法：还有一些其他方式也被用来实现动物细胞膜的识别信息，例如脂类分子的介导，或者细胞表面微结构的形成等等。总之，动物细胞膜的识别信息是通过多种...